Examinando por Autor "Maldonado Zuluaga, Camilo"

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    ÍtemAcceso abierto
    Metodología de purificación del complejo proteico SOSS para su uso en estudios de caracterización estructural
    (Universidad EIA, 2023) Maldonado Zuluaga, Camilo; Marín Muñoz, Paula Andrea
    RESUMEN: En una célula eucariota la función más importante del ciclo celular es duplicar la gran cantidad de material genético organizada en sus cromosomas y segregar dos copias de esta información en dos células hijas genéticamente idénticas. La integridad genómica de una célula es constantemente lesionada por mecanismos endógenos y exógenos conduciendo a la formación de mutaciones importantes y otros desordenes en el metabolismo celular. En respuesta a los diferentes tipos de daño en el genoma, la célula ha desarrollado diferentes mecanismos de reparo especializados, entre ellos el mecanismo de recombinación homóloga (HR) para reparación de roturas de doble cadena de ADN. Se sabe que una de las proteínas que participa del proceso de HR y media en su regulación es el complejo proteico SOSS (Sensor of Single Stranded DNA) sin embargo, no se conoce con claridad su rol en este mecanismo de reparación. Para entender su papel en este y otros procesos es importante obtener un modelo tridimensional del complejo para determinar la función específica de esta proteína a partir de su estructura y conformación. Para que este complejo pueda ser analizado estructuralmente debe ser purificado y homogenizado antes de ser estudiado desde el punto de vista estructural. En la presente tesina se desarrolló una metodología de purificación para el complejo proteico SOSS que permitió obtener una muestra con alto contenido de proteína y con un nivel de homogeneidad adecuado para posteriores estudios de caracterización estructural mediante microscopía crioelectrónica. Para ello se plantearon las condiciones más relevantes para la purificación del complejo SOSS y se establecieron los parámetros de la purificación. Luego se implementó la tecnología del ADN recombinante en células de insecto para obtener extractos proteicos con alto contenido del complejo SOSS soluble. Finalmente, empleando la técnica de cromatografía de afinidad en columnas de Níquel se obtuvo la proteína purificada y su homogeneidad fue valorada mediante la técnica de tinción negativa. Adicionalmente, se presentan resultados de caracterización del complejo proteico MRN (MRE11 – RAD50 – NBS1) mediante ensayos de nucleasas como método inicial para estimar la interacción entre el complejo SOSS y el complejo MRN, un clásico sensor del mecanismo de HR luego de una ruptura de doble cadena en el ADN.