Publicación: Evaluación in vitro de una formulación de resveratrol como posible tratamiento de la retinopatía diabética
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RESUMEN: La retinopatía diabética proliferativa se caracteriza por la formación de vasos sanguíneos frágiles que pueden causar hemorragia vítrea o desprendimiento de retina a medida que los vasos crecen en el vítreo, lo cual incrementa sustancialmente el riesgo de pérdida visual, como consecuencia adicional de la inflamación crónica y estrés oxidativo. Los efectos secundarios de los tratamientos actuales sugieren la búsqueda de tratamientos complementarios menos invasivos que permitan la administración de agentes terapéuticos en el sitio específico. El resveratrol (RSV) se postula como una molécula prometedora debido a sus propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y antiangiogénicas, y que ha sido ampliamente reportado en el tratamiento de enfermedades oculares. A su vez, las nanosuspensiones para la administración tópica del fármaco son una alternativa que puede complementar los tratamientos actuales, y que puede conservar las propiedades del RSV, aumentando su solubilidad y biodisponibilidad. Con el desarrollo de esta investigación se evaluó el efecto antiinflamatorio y antiangiogénico de una nanosuspensión de resveratrol (RSV-NS) como posible tratamiento para la retinopatía diabética proliferativa. Las propiedades morfológicas y estructurales se analizaron mediante dispersión dinámica de luz, microscopía electrónica de transmisión de barrido y espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier. Los efectos biológicos de RSV-NS fueron inicialmente analizados en un cultivo primario no estimulado de células endoteliales microvasculares de retina humana (HRMECs), a través del estudio de la actividad metabólica, citotoxicidad y proliferación. El efecto antiinflamatorio de RSV-NS se evaluó en las HRMECs estimuladas con TNF-⍺ con la expresión de ARN mediante RT-qPCR; por otro lado, el efecto antiangiogénico de la RSV se estimó en las HRMECs estimuladas con VEGF mediante ensayos de proliferación, migración y formación de tubos. RSV-NS presentó una apariencia traslúcida, con un tamaño promedio de partícula de 304,0 ± 81,21 nm, índice de polidispersión de 0,225 ± 0,036, distribución de partícula monomodal uniforme, y una morfología con tendencia esférica menor a 500 nm. De acuerdo con los ensayos de MTT/CCK-8 y LDH, la actividad metabólica promedio de RSV-NS a 18,75 µM fue mayor al 70 %, comparado con el control, sin tener efectos citotóxicos en las células. Para los modelos celulares in vitro de estrés celular, en donde las HRMECs fueron a estimuladas con TNF-⍺ o VEGF para simular las condiciones de la retinopatía diabética, hubo una disminución significativa en la expresión de TNF-⍺ e IL-6 cuando las células fueron tratadas con 18,75 µM, respecto al control estimulado con 10 ng/mL de TNF-⍺. Asimismo, RSV-NS a 18,75 µM redujo la proliferación, migración celular y formación de tubos en el modelo in vitro estimulado con VEGF a 10 ng/mL. En conclusión, los resultados de este proyecto sugieren un posible efecto antiinflamatorio y antiangiogénico de una nanosuspensión de resveratrol en modelos in vitro de estrés en HRMECs estimuladas con TNF-⍺ o VEGF, para su potencial aplicación en el tratamiento de la retinopatía diabética proliferativa.
Resumen en inglés
ABSTRACT: Proliferative diabetic retinopathy is characterized by the formation of aberrant blood vessels that can cause vitreous hemorrhage or retinal detachment as the vessels grow into the vitreous, substantially increasing the risk of visual loss, as an additional consequence of chronic inflammation and oxidative stress. Side effects of current treatments suggest the search for less invasive complementary treatments that allow site-specific delivery of therapeutic agents. Resveratrol (RSV) is suggested as a promising molecule due to its antioxidant, anti-inflammatory, and antiangiogenic properties, and it has been widely reported in the treatment of ocular diseases. In turn, nanosuspensions for topical administration of the drug are an alternative that can complement current treatments, and that can preserve the properties of RSV, by increasing its solubility and bioavailability. The anti-inflammatory and antiangiogenic effects of a resveratrol nanosuspension (RSV-NS) were evaluated in this research, as a possible treatment for proliferative diabetic retinopathy. Morphological and structural properties were analyzed by dynamic light scattering, transmission scanning electron microscopy, and Fourier transform infrared spectroscopy. The biological effects of RSV-NS were initially analyzed in a primary culture of unstimulated human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs) through the study of metabolic activity, cytotoxicity, and proliferation. The anti-inflammatory effect of RSV-NS was evaluated in TNF-stimulated HRMECs with RNA expression by RT-qPCR. On the other hand, the antiangiogenic effect of RSV was estimated in VEGF-stimulated HRMECs by proliferation, migration, and tube formation assays. RSV-NS presented a translucent appearance, with an average particle size of 304.0 ± 81.21 nm, polydispersity index of 0.225 ± 0.036, uniform monomodal particle size distribution, and a spherical-like morphology of less than 500 nm in size. According to the MTT/CCK-8 and LDH assays, the average metabolic activity of RSV-NS at 18.75 µM was greater than 70%, compared to the control, without having cytotoxic effects on the cells. For in vitro cellular models of cell stress, where HRMECs were stimulated with TNF-⍺ or VEGF to simulate the conditions of diabetic retinopathy, there was a significant decrease in the expression of TNF-⍺ and IL-6 when the cells were treated with RSV-NS at 18.75 µM, compared to the control stimulated with 10 ng/mL of TNF-⍺. Likewise, RSV-NS at 18.75 µM reduced proliferation, cell migration, and tube formation in the in vitro model stimulated with VEGF at 10 ng/mL. In conclusion, the results of this project suggest a possible anti-inflammatory and antiangiogenic effect of the resveratrol nanosuspension on in vitro models of stress in HRMECs stimulated with TNF-⍺ or VEGF, for its potential application in the treatment of proliferative diabetic retinopathy.